基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究(1)
[摘要] 该文选择成药六味地黄丸为研究对象，建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术。首先以原料药材丹皮DNA为模板，筛选最适荧光标记鉴别引物，即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)分别对5个FAM荧光标记引物psbA-trnH，ITS，trnL-trnF，matK，rbcL序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。根据分析结果最终选择psbA-trnH荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材。结果表明，通过psbA-trnH荧光标记引物扩增分析，可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮，山药，泽泻3种原料药材。研究结果说明，采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性。
[关键词] 中成药； 分子鉴别； FAM荧光标记； psbA-trnH
六味地黄丸最早记载于宋代钱乙《小儿药证直诀·卷下诸方》，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮、茯苓组成，是中医滋补肾阴的代表方剂，在中成药中具有极其重要的地位。现代药理研究表明，六味地黄丸有增强免疫、抗肿瘤[1]、抗衰老[2]、降血糖、降血脂，降血压、防癌抗癌对泌尿生殖系统。内分泌系统和心血管系统有明显的影响[3-4]。临床主要用于治疗糖尿病肝肾阴虚[5]、高血压[6]、肾炎[7]等疾病。在2010年版药典中，规定以检测牡丹皮中的丹皮酚和酒萸肉中的马钱苷的含量作为六味地黄丸质量控制的指标[8]。但这2种成分在其他药材中也存在，且六味地黄丸的成分十分复杂，仅测定其中的2种成分很难真实客观地反映其原料药材的真伪，因此需要寻找更好的质量控制方法。
, 百拇医药
利用分子生物学技术依据遗传物质DNA在不同生物个体的差异鉴别生物物种，具有快速、微量样本、不受外界环境条件的影响、鉴别特异性强等特点，在中药材品种鉴别领域显示出极强的优势。但目前该技术在中成药中原料药材鉴别应用报道较少，Megan等采用高通量测序技术对牙痛一粒丸等15种中成药中的原料药材进行了分子鉴定[9]；崔占虎等[10]基于序列分析方法，利用选择叶绿体基因片段psbA-trnH和rbcL对连翘败毒丸中的19种原料药进行分子鉴定，结果表明大黄、苦地丁、金银花、苦参、麻黄、荆芥等10种原料药材的物种基原可以鉴定出来，但以上2种方法测定时间较长，且数据处理复杂。
荧光测序分析技术是通过对荧光标记的DNA片段进行检测，结合相对分子质量内标对样品DNA片段长度进行计算，并根据DNA片段长度差异进行物种鉴别。本文拟利用该技术建立六味地黄丸中的丹皮等原料药材基原真伪鉴别方法，为六味地黄丸的质量检控提供了新的技术手段，也为中成药质量控制及人们用药安全提供支撑。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样品
丹皮基原植物9株、地黄基原植物3株，分别采自安徽、山东、北京、河南等地；丹皮药材6批，山茱萸药材2批、山药药材3批、地黄药材3批和泽泻药材2批以及成药六味地黄丸均购自市场。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和安徽中医学院，实验材料采集及鉴定信息见表1。
1.2 试剂
2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖(Promega公司)，溴化乙锭(Fluka公司)，DNA Taq聚合酶(Takara公司)，2 000 bp DNA Marker(Takara公司)，GENESCAN 500LIZ内标(ABI公司，货号4322682)，GENESCAN 1200LIZ内标(ABI公司，货号4397728)，DNA纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，牛血清白蛋白BSA S100(江晨生物)，聚乙烯吡咯烷酮 PVP40(江晨生物)，三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.3 仪器
PCR仪(ABI公司，型号 9700)，电泳系统(北京市六一仪器厂，型号 DYY-12)，低温冷冻离心机(德国Eppendorf， 型号 5810R)，紫外凝胶成像分析仪(英国Syngene， 型号 GBOXHR)，混合型球磨仪(德国Retsch，型号 MM400)，微量移液器(德国Eppendorf)。
1.4 荧光标记引物的选择及修饰
本实验选择5对通用引物，包括核内转录间隔区序列(ITS)，叶绿体基因间隔区 (psbA-trnH和trnL-trnF)和叶绿体编码区(matK和rbcL)[11-13]。分别在每对引物的正向引物的5′端进行FAM荧光标记修饰。引物序列及反应条件见表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.5 总DNA提取及PCR扩增
, 百拇医药
1.5.1 DNA提取 六味地黄丸取适量样品，研磨破碎装入50 mL 离心管中，采用改良CTAB法提取总DNA。原料药材或基原植物取适量的样品，研磨破碎装入2.0 mL微量离心管中，采用改良CTAB法提取原料药材的总DNA。
1.5.2 DNA纯化 分别将提取后的六味地黄丸、原料药材熟地黄总DNA使用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后的DNA置于-20 ℃备用。
1.5.3 PCR扩增 反应体系总体积为20 μL，包括10×buffer缓冲液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。六味地黄丸扩增体系总体积仍为20 μL，其中减少灭菌蒸馏水的体积，加入BSA 0.5 μL，PVP 1 μL。各对引物PCR反应条件见表2。反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。, 百拇医药(崔占虎 黄璐琦 袁媛 李旻辉 蒋超 周立社)
[关键词] 中成药； 分子鉴别； FAM荧光标记； psbA-trnH
六味地黄丸最早记载于宋代钱乙《小儿药证直诀·卷下诸方》，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮、茯苓组成，是中医滋补肾阴的代表方剂，在中成药中具有极其重要的地位。现代药理研究表明，六味地黄丸有增强免疫、抗肿瘤[1]、抗衰老[2]、降血糖、降血脂，降血压、防癌抗癌对泌尿生殖系统。内分泌系统和心血管系统有明显的影响[3-4]。临床主要用于治疗糖尿病肝肾阴虚[5]、高血压[6]、肾炎[7]等疾病。在2010年版药典中，规定以检测牡丹皮中的丹皮酚和酒萸肉中的马钱苷的含量作为六味地黄丸质量控制的指标[8]。但这2种成分在其他药材中也存在，且六味地黄丸的成分十分复杂，仅测定其中的2种成分很难真实客观地反映其原料药材的真伪，因此需要寻找更好的质量控制方法。
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利用分子生物学技术依据遗传物质DNA在不同生物个体的差异鉴别生物物种，具有快速、微量样本、不受外界环境条件的影响、鉴别特异性强等特点，在中药材品种鉴别领域显示出极强的优势。但目前该技术在中成药中原料药材鉴别应用报道较少，Megan等采用高通量测序技术对牙痛一粒丸等15种中成药中的原料药材进行了分子鉴定[9]；崔占虎等[10]基于序列分析方法，利用选择叶绿体基因片段psbA-trnH和rbcL对连翘败毒丸中的19种原料药进行分子鉴定，结果表明大黄、苦地丁、金银花、苦参、麻黄、荆芥等10种原料药材的物种基原可以鉴定出来，但以上2种方法测定时间较长，且数据处理复杂。
荧光测序分析技术是通过对荧光标记的DNA片段进行检测，结合相对分子质量内标对样品DNA片段长度进行计算，并根据DNA片段长度差异进行物种鉴别。本文拟利用该技术建立六味地黄丸中的丹皮等原料药材基原真伪鉴别方法，为六味地黄丸的质量检控提供了新的技术手段，也为中成药质量控制及人们用药安全提供支撑。
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1 材料与方法
1.1 样品
丹皮基原植物9株、地黄基原植物3株，分别采自安徽、山东、北京、河南等地；丹皮药材6批，山茱萸药材2批、山药药材3批、地黄药材3批和泽泻药材2批以及成药六味地黄丸均购自市场。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和安徽中医学院，实验材料采集及鉴定信息见表1。
1.2 试剂
2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖(Promega公司)，溴化乙锭(Fluka公司)，DNA Taq聚合酶(Takara公司)，2 000 bp DNA Marker(Takara公司)，GENESCAN 500LIZ内标(ABI公司，货号4322682)，GENESCAN 1200LIZ内标(ABI公司，货号4397728)，DNA纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，牛血清白蛋白BSA S100(江晨生物)，聚乙烯吡咯烷酮 PVP40(江晨生物)，三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。
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1.3 仪器
PCR仪(ABI公司，型号 9700)，电泳系统(北京市六一仪器厂，型号 DYY-12)，低温冷冻离心机(德国Eppendorf， 型号 5810R)，紫外凝胶成像分析仪(英国Syngene， 型号 GBOXHR)，混合型球磨仪(德国Retsch，型号 MM400)，微量移液器(德国Eppendorf)。
1.4 荧光标记引物的选择及修饰
本实验选择5对通用引物，包括核内转录间隔区序列(ITS)，叶绿体基因间隔区 (psbA-trnH和trnL-trnF)和叶绿体编码区(matK和rbcL)[11-13]。分别在每对引物的正向引物的5′端进行FAM荧光标记修饰。引物序列及反应条件见表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.5 总DNA提取及PCR扩增
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1.5.1 DNA提取 六味地黄丸取适量样品，研磨破碎装入50 mL 离心管中，采用改良CTAB法提取总DNA。原料药材或基原植物取适量的样品，研磨破碎装入2.0 mL微量离心管中，采用改良CTAB法提取原料药材的总DNA。
1.5.2 DNA纯化 分别将提取后的六味地黄丸、原料药材熟地黄总DNA使用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后的DNA置于-20 ℃备用。
1.5.3 PCR扩增 反应体系总体积为20 μL，包括10×buffer缓冲液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。六味地黄丸扩增体系总体积仍为20 μL，其中减少灭菌蒸馏水的体积，加入BSA 0.5 μL，PVP 1 μL。各对引物PCR反应条件见表2。反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。, 百拇医药(崔占虎 黄璐琦 袁媛 李旻辉 蒋超 周立社)