HPLC同时测定西藏栽培天麻中天麻素和8种核苷及碱基类成分(1)
[摘要]本实验建立了同时测定天麻药材中天麻素及8种核苷和碱基类成分的高效液相色谱法：Agilent Zorbax Bonus-RP(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-(0.04%冰乙酸)水溶液为流动相，梯度洗脱，柱温36 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm，进样量20 μL。该方法分离度良好，天麻素、胞嘧啶、胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷和腺苷等的质量浓度在2.04～262.00，0.20～24.67，0.18～23.75，0.20～25.83，0.20～26.67，0.16～ 20.00，0.22～27.71，0.20～24.29，0.24～ 30.58 mg·L-1内，相关系数r在0.998 9～0.999 9，具有良好的线性。天麻素和8种核苷及碱基平均加标回收率在96.4%～99.6%，RSD均小于2.7%(n=6)。测定了7个西藏栽培天麻药材中上述9种成分的含量。结果表明，7个天麻样品中天麻素的含量均高于2.0 mg·g-1，均含有较高的腺苷、鸟苷、尿苷和胞嘧啶，而胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶含量较低。该方法简便、准确，重复性好，适用于天麻药材中天麻素和腺苷等8种核苷及碱基类成分的含量测定。
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[关键词]西藏栽培天麻；天麻素；核苷和碱基；同时测定；高效液相色谱法
天麻Gastrodia elata B.L为我国常用名贵中药，属兰科多年生草本共生植物，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效[1]。现代药理学研究表明天麻具有镇静安眠、抗惊厥、抗焦虑、神经保护、镇痛、增强血液循环系统功能、增强免疫和抗遗忘抗衰老等作用[2]。天麻药材中含有天麻素、腺苷、尿苷、腺嘌呤、尿嘧啶、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲酸等多种活性成分[1-3]。
现行中国药典以天麻素为主要质量控制指标[1]，对天麻进行质量控制的文献报道也主要集中在天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等[4-6]的含量分析上。天麻药材中多种核苷和碱基类成分与天麻素的同时测定尚未见报道。腺苷等核苷和碱基类成分具有较强的生理活性和药理作用[7]，为天麻药材多种药理功效的物质基础。
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为更加客观、全面的评价天麻质量，对其进行质量控制，进一步探讨天麻的药理作用，本实验建立了天麻素及胞嘧啶、胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷等8种核苷和碱基类成分同时测定的HPLC方法，并对西藏栽培天麻药材进行了含量分析。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪(配备G1379A在线脱气机，G1312A二元高压泵，G1328A手动进样器，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器)，Chemstation 色谱工作站；AG135型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PL203型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PS-60 型洁康牌超声波清洗仪(360W，40KHZ)(东莞市洁康超声波设备有限公司)；TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，UPT-Ⅱ-20L 型优普U LU PURE 型超纯水机(成都优普超纯科技有限公司)。
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1.2 试药
对照品：天麻素Gastrodin(批号110807-200205)、腺苷Adenosine(批号110879-200202)购于中国食品药品检定研究院，纯度≥98%；尿苷Uridine(批号1100986021)鸟苷Guanosine(批号1000880080)、尿嘧啶Uracil(批号1000996074)、胸腺嘧啶Thymine(批号101063335)、胞嘧啶Cytosine(批号1001028769)、腺嘌呤Adenine(批号1000977038)、胞苷Cytidine(批号101144695)均购于sigma公司，纯度≥99.0%。
1.3 试剂
甲醇(色谱纯，山东禹王化学试剂厂)，水为自制超纯水(成都优普超纯科技有限公司)，其他试剂均为分析纯。
1.4 药材
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7份天麻样品为2012年7至8月购买自西藏林芝地区波密县松宗镇、扎木镇、倾多镇和古乡，其中倾多镇3份，古乡2份，松宗镇和扎木镇各1份，所有样品均经中国科学院西北高原生物研究所副研究员、中药执业药师杜玉枝老师鉴定为天麻G. elata B.L，药材经烘干后粉碎，过80目筛，备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Zorbax Bonus-RP C18 色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相A相为0.04%乙酸水溶液，B相为甲醇，流速为1.0 mL·min-1；柱温36 ℃；检测波长254nm；进样量20 μL；洗脱程序，见表1。
在上述色谱条件下，天麻素、胞嘧啶、胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷和腺苷得到良好分离，混合对照品和天麻样品(松宗镇)色谱图，见图1。
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2.2 对照品与供试品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取各对照品，天麻素3.93 mg、胞嘧啶5.92 mg、胞苷5.70 mg、尿嘧啶6.20 mg、腺嘌呤6.40 mg、尿苷4.80 mg、胸腺嘧啶6.65mg、鸟苷5.83 mg、腺苷7.34 mg置于10 mL的量瓶中，用10%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀，配制成单标溶液，浓度分别为393.00 mg·L-1，592.00 mg·L-1，570.00 mg·L-1，620.00 mg·L-1，640.00 mg·L-1，480.00 mg·L-1，665.00, http://www.100md.com(肖远灿 董琦 迟晓峰 谭亮 胡风祖)
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[关键词]西藏栽培天麻；天麻素；核苷和碱基；同时测定；高效液相色谱法
天麻Gastrodia elata B.L为我国常用名贵中药，属兰科多年生草本共生植物，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效[1]。现代药理学研究表明天麻具有镇静安眠、抗惊厥、抗焦虑、神经保护、镇痛、增强血液循环系统功能、增强免疫和抗遗忘抗衰老等作用[2]。天麻药材中含有天麻素、腺苷、尿苷、腺嘌呤、尿嘧啶、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲酸等多种活性成分[1-3]。
现行中国药典以天麻素为主要质量控制指标[1]，对天麻进行质量控制的文献报道也主要集中在天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等[4-6]的含量分析上。天麻药材中多种核苷和碱基类成分与天麻素的同时测定尚未见报道。腺苷等核苷和碱基类成分具有较强的生理活性和药理作用[7]，为天麻药材多种药理功效的物质基础。
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为更加客观、全面的评价天麻质量，对其进行质量控制，进一步探讨天麻的药理作用，本实验建立了天麻素及胞嘧啶、胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷等8种核苷和碱基类成分同时测定的HPLC方法，并对西藏栽培天麻药材进行了含量分析。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪(配备G1379A在线脱气机，G1312A二元高压泵，G1328A手动进样器，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器)，Chemstation 色谱工作站；AG135型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PL203型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PS-60 型洁康牌超声波清洗仪(360W，40KHZ)(东莞市洁康超声波设备有限公司)；TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，UPT-Ⅱ-20L 型优普U LU PURE 型超纯水机(成都优普超纯科技有限公司)。
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1.2 试药
对照品：天麻素Gastrodin(批号110807-200205)、腺苷Adenosine(批号110879-200202)购于中国食品药品检定研究院，纯度≥98%；尿苷Uridine(批号1100986021)鸟苷Guanosine(批号1000880080)、尿嘧啶Uracil(批号1000996074)、胸腺嘧啶Thymine(批号101063335)、胞嘧啶Cytosine(批号1001028769)、腺嘌呤Adenine(批号1000977038)、胞苷Cytidine(批号101144695)均购于sigma公司，纯度≥99.0%。
1.3 试剂
甲醇(色谱纯，山东禹王化学试剂厂)，水为自制超纯水(成都优普超纯科技有限公司)，其他试剂均为分析纯。
1.4 药材
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7份天麻样品为2012年7至8月购买自西藏林芝地区波密县松宗镇、扎木镇、倾多镇和古乡，其中倾多镇3份，古乡2份，松宗镇和扎木镇各1份，所有样品均经中国科学院西北高原生物研究所副研究员、中药执业药师杜玉枝老师鉴定为天麻G. elata B.L，药材经烘干后粉碎，过80目筛，备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Zorbax Bonus-RP C18 色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相A相为0.04%乙酸水溶液，B相为甲醇，流速为1.0 mL·min-1；柱温36 ℃；检测波长254nm；进样量20 μL；洗脱程序，见表1。
在上述色谱条件下，天麻素、胞嘧啶、胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷和腺苷得到良好分离，混合对照品和天麻样品(松宗镇)色谱图，见图1。
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2.2 对照品与供试品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取各对照品，天麻素3.93 mg、胞嘧啶5.92 mg、胞苷5.70 mg、尿嘧啶6.20 mg、腺嘌呤6.40 mg、尿苷4.80 mg、胸腺嘧啶6.65mg、鸟苷5.83 mg、腺苷7.34 mg置于10 mL的量瓶中，用10%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀，配制成单标溶液，浓度分别为393.00 mg·L-1，592.00 mg·L-1，570.00 mg·L-1，620.00 mg·L-1，640.00 mg·L-1，480.00 mg·L-1，665.00, http://www.100md.com(肖远灿 董琦 迟晓峰 谭亮 胡风祖)