RGD多肽表面修饰对HA-TCP生物陶瓷修复骨缺损的影响(1)
[摘要]目的：了解精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)多肽表面修饰对羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatine-tricalcium phosphate，HA-TCP)修复节段性骨缺损的影响。方法：以骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，Mscs)复合RGD多肽表面修饰的HA-TCP或单纯材料培养制备组织工程骨，选择60只新西兰白兔，制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型，实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA-TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入Mscs复合HA-TcP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA-TCP；D组：骨缺损区植入HA-TCP。术后4、8、16周取材，行X线检查、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定。结果：术后4、8、16周各组骨缺损区均有新骨生成，成骨量随时间的推移而增加。经X线、组织学和生物力学评估，成骨能力依次为：A>B>C>D(P<0.001，P<0.05)，其中A组术后16周骨缺损完全修复，骨髓腔再通，生物力学性能接近正常骨。结论：RGD多肽表面修饰对以HA-TCP为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。
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[关键词]组织工程；表面修饰；骨髓基质干细胞；修复
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)06-0723-04
RGD多肽是介导种子细胞与支架材料粘附的多肽链，RGD序列可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面白发形成一分子层，为与受体介导的种子细胞提供特异性位点而促进细胞的粘附和分化。本研究旨在应用RGD多肽对HA-TCP材料进行表面修饰处理，以促进MSCs在其表面的粘附和生长，为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。
1 材料和方法
1.1 材料准备：HA-TCP双相多孔生物陶瓷(四川大学生物材料工程研究中心)含60%HA和40%TCP，孔隙率为50%～70%，孔隙直径为200～500~m。将材料修整为1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸馏水加压反复冲洗，去离子水超声清洗2次，每次30min，高压蒸汽灭菌后备用。将RGD多肽(美国Peptide生物工程公司)溶解于50%乙醇中，浓度为2mmol/L。将材料分别置于带胶皮塞的离心管中，加入RGD多肽溶液，负压抽吸使RGD多肽溶液进入材料孔隙内，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值为7.4的0.0lmol/L PBS漂洗至中性，晾干。
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1.2 组织工程骨制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1 800r/min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106/ml密度接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90%生长面积时用0.25%胰蛋白酶(sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含1×10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C和1×10-2mol/L β-磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×106/ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5%CO2饱和湿度培养7天。
1.3 动物模型和实验分组：选择3周龄雌性新西兰白兔60只，体重为2.0～2.5kg。动物全身麻醉后，常规消毒双上肢，沿上肢前外侧做纵行切口，长25mm，逐层切开、分离、显露桡骨，于桡骨中上1/3交界处截骨，去除桡骨和骨膜，制造15mm长的右侧肢体桡骨节段性骨缺损模型。实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，每组实验动物10只，其中A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA-TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA-TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA-TCP；D组：骨缺损区植入HA-TCP。
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1.4 检测项目
1.4.1大体观察和x线检查：术后观察动物饮食、活动，伤口有无肿胀、分泌物等。术后4、8及16周X线摄片，根据Lane等(1987)的X线评分标准对各组移植区骨形成、骨连接和骨塑形进行评分。术后4、8及16周处死动物，取尺桡骨全段，观察移植物的颜色、质地和血管形成，与宿主骨融合和周围软组织分布情况。
1.4.2 组织学观察：标本经4%多聚甲醛固定后，乙醇梯度脱水，有机树脂包埋。用硬组织切片机(德国Leica公司)制作厚度为5μm切片标本，行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察移植区的骨愈合情况。用MLAS医用计算机图像分析系统(四川大学计算机学院)采集术后4周和16周的组织切片，在4倍物镜下寻找包含移植材料的视野，计算每一视野中材料与材料内所形成新骨的面积百分比。
1.4.3 生物力学测定：用万能材料试验机(美国Instron公司)测量各实验组术后16周尺桡骨标本的最大扭转强度，以正常兔的尺桡骨为对照。
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1.5 统计学方法：采用SPSS 10.0软件包对检查结果行多个样本均数的方差分析和两两比较的口检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察：各组动物术后上肢均有不同程度肿胀，1周后症状消失。术后4周，A和B组移植材料与宿主骨界线不清，结合牢固，推之不动，有骨痂向材料中央延伸。C和D组移植材料与宿主骨界线清晰，周围有大量纤维组织和血管长入。术后8周，A和B组移植材料与宿主骨牢固融合，材料表面有坚硬外骨痂形成，骨痂开始塑形。C和D组移植材料与宿主骨界线模糊，移植材料与宿主骨交界有大量骨痂形成。术后16周，各组移植材料被骨痂完全包围，移植材料与宿主骨界线消失。术后各时期，移植材料周围软组织未见变性、坏死和囊性变。
2.2 X线检查
2.2.1 X线观察：A和B组术后4周，截骨端有新骨形成，移植材料纹理模糊；8周，大量新骨形成，移植材料边界不清，部分髓腔再通；16周，新生皮质骨与宿主皮质骨自然连接，显示出正常骨干结构，移植材料分辨不清，髓腔再通。C和D组术后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料纹理清晰；8周，大量新生骨向材料中心生长，移植材料边界不清；16周，髓, http://www.100md.com(蓝 旭 梁 军 葛宝丰 刘雪梅)
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[关键词]组织工程；表面修饰；骨髓基质干细胞；修复
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)06-0723-04
RGD多肽是介导种子细胞与支架材料粘附的多肽链，RGD序列可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面白发形成一分子层，为与受体介导的种子细胞提供特异性位点而促进细胞的粘附和分化。本研究旨在应用RGD多肽对HA-TCP材料进行表面修饰处理，以促进MSCs在其表面的粘附和生长，为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。
1 材料和方法
1.1 材料准备：HA-TCP双相多孔生物陶瓷(四川大学生物材料工程研究中心)含60%HA和40%TCP，孔隙率为50%～70%，孔隙直径为200～500~m。将材料修整为1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸馏水加压反复冲洗，去离子水超声清洗2次，每次30min，高压蒸汽灭菌后备用。将RGD多肽(美国Peptide生物工程公司)溶解于50%乙醇中，浓度为2mmol/L。将材料分别置于带胶皮塞的离心管中，加入RGD多肽溶液，负压抽吸使RGD多肽溶液进入材料孔隙内，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值为7.4的0.0lmol/L PBS漂洗至中性，晾干。
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1.2 组织工程骨制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1 800r/min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106/ml密度接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90%生长面积时用0.25%胰蛋白酶(sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含1×10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C和1×10-2mol/L β-磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×106/ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5%CO2饱和湿度培养7天。
1.3 动物模型和实验分组：选择3周龄雌性新西兰白兔60只，体重为2.0～2.5kg。动物全身麻醉后，常规消毒双上肢，沿上肢前外侧做纵行切口，长25mm，逐层切开、分离、显露桡骨，于桡骨中上1/3交界处截骨，去除桡骨和骨膜，制造15mm长的右侧肢体桡骨节段性骨缺损模型。实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，每组实验动物10只，其中A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA-TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA-TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA-TCP；D组：骨缺损区植入HA-TCP。
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1.4 检测项目
1.4.1大体观察和x线检查：术后观察动物饮食、活动，伤口有无肿胀、分泌物等。术后4、8及16周X线摄片，根据Lane等(1987)的X线评分标准对各组移植区骨形成、骨连接和骨塑形进行评分。术后4、8及16周处死动物，取尺桡骨全段，观察移植物的颜色、质地和血管形成，与宿主骨融合和周围软组织分布情况。
1.4.2 组织学观察：标本经4%多聚甲醛固定后，乙醇梯度脱水，有机树脂包埋。用硬组织切片机(德国Leica公司)制作厚度为5μm切片标本，行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察移植区的骨愈合情况。用MLAS医用计算机图像分析系统(四川大学计算机学院)采集术后4周和16周的组织切片，在4倍物镜下寻找包含移植材料的视野，计算每一视野中材料与材料内所形成新骨的面积百分比。
1.4.3 生物力学测定：用万能材料试验机(美国Instron公司)测量各实验组术后16周尺桡骨标本的最大扭转强度，以正常兔的尺桡骨为对照。
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1.5 统计学方法：采用SPSS 10.0软件包对检查结果行多个样本均数的方差分析和两两比较的口检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察：各组动物术后上肢均有不同程度肿胀，1周后症状消失。术后4周，A和B组移植材料与宿主骨界线不清，结合牢固，推之不动，有骨痂向材料中央延伸。C和D组移植材料与宿主骨界线清晰，周围有大量纤维组织和血管长入。术后8周，A和B组移植材料与宿主骨牢固融合，材料表面有坚硬外骨痂形成，骨痂开始塑形。C和D组移植材料与宿主骨界线模糊，移植材料与宿主骨交界有大量骨痂形成。术后16周，各组移植材料被骨痂完全包围，移植材料与宿主骨界线消失。术后各时期，移植材料周围软组织未见变性、坏死和囊性变。
2.2 X线检查
2.2.1 X线观察：A和B组术后4周，截骨端有新骨形成，移植材料纹理模糊；8周，大量新骨形成，移植材料边界不清，部分髓腔再通；16周，新生皮质骨与宿主皮质骨自然连接，显示出正常骨干结构，移植材料分辨不清，髓腔再通。C和D组术后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料纹理清晰；8周，大量新生骨向材料中心生长，移植材料边界不清；16周，髓, http://www.100md.com(蓝 旭 梁 军 葛宝丰 刘雪梅)