硒化壳聚糖促表皮细胞增殖作用的实验研究
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1.2.4 LDH漏出率的测定：取第6代细胞， 5×103个/ml接种于96孔板，每孔接种100μl,培养48h, 按分组加入不同浓度的硒化壳聚糖继续培养24h，用全自动生化分析仪检测上清液中LDH的含量，将培养板中的细胞用0.25%胰酶消化，收集细胞，超声波粉碎后加入PBS液，用全自动生化分析仪检测LDH的含量,LDH漏出率的计算公式[7]：
漏出率＝(LDH上清液-LDH胞内)/ LDH胞内。
1.2.5统计学处理 数据均以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。
2结果
2.1电镜下观察结果：透射电镜下空白组的细胞核仁可见，多为单个，少量细胞也可见多个核仁, 细胞表面可见微绒毛。各浓度硒化壳聚糖组细胞表面微绒毛丰富，核大，扭曲明显，有深凹陷，核内异染色质稍多，呈小斑块状散在分布于核基质中，核仁大，常多个(2～3个)有时可达4个，有少数细胞体积明显增大，部分细胞内见多个核切面。细胞浆内糖原丰富，有线粒体和粗面内质网，有些高尔基体也较发达，细胞多处于分裂期。见图1。
2.2硒化壳聚糖对表皮细胞LDH漏出率和DNA合成的影响: 硒化壳聚糖可降低表皮细胞LDH漏出率，药物浓度越大漏出率降低越明显，呈剂量依赖趋势，当药物浓度为100mg/L及以上时，对LDH漏出率的影响与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05, P<0.01)。各浓度硒化壳聚糖均可促进表皮细胞对3H-TdR的摄入, 25mg/L组cpm值即大于空白对照组(P<0.05),200、400mg/L组cpm值远大于空白对照组(P<0.01)。见表1。
3讨论
3.1 创面愈合是一个复杂有序的过程，深度损伤的修复主要通过肉芽组织的生成来实现，浅表损伤修复则主要通过上皮细胞的增殖、迁移来完成。创面愈合包括炎症反应、细胞增殖、创面成熟和重建三个阶段，炎症反应启动并全程参与了创面修复过程，硒化壳聚糖主要是由具有抗炎等活性的硒和壳聚糖合成，理应会对创面愈合过程产生影响，而前期的研究也证实了其能通过影响一氧化氮和相关细胞因子的分泌促进肉芽组织中主要细胞皮肤成纤维细胞增殖和胶原的合成[8-9]。
3.2 本文中，笔者在电镜下观察了经硒化壳聚糖处理后的表皮细胞，结果显示，细胞内各超微结构均呈现出增殖旺盛的特征，浓度越高，增殖旺盛特征越明显。细胞生物学研究表明，分裂旺盛的细胞呈现出细胞核变大、核仁增多、增大、细胞表面突起增多等特征。糖原是细胞合成、分泌、代谢等生物学活动的能量来源，糖原增多可间接提示细胞代谢旺盛；粗面内质网是由内质网和核糖体共同形成的一个复合机能单位，是细胞进行生物合成的重要基地，其发达程度可作为判断细胞分化和功能状态的指标，细胞合成代谢活跃或分泌活动旺盛时粗面内质网数目增多，功能相对减弱时则数目减少。为进一步验证硒化壳聚糖对表皮细胞的促增殖作用，笔者又采用了3H-TdR掺入法进行检测，脱氧胸腺嘧啶核苷酸(TdR)是合成DNA的原料之一，细胞增殖旺盛则DNA合成加快，细胞对TdR的需求量增加。结果发现经硒化壳聚糖作用后表皮细胞对3H-TdR掺入量明显增强，促进了表皮细胞DNA的合成和增殖，与电镜下观察结果一致。
3.3 LDH是存在于细胞浆内参与糖酵解反应的酶，进行离体细胞培养时，如果培养的细胞受损，LDH会由细胞漏出至培养液中，通过测定培养液中LDH水平可衡量细胞受损的程度，间接反映药物的安全性[10]。本实验中硒化壳聚糖非但没有增加，相反却能降低LDH漏出率，说明硒化壳聚糖对表皮细胞尚有一定的保护作用，这与在细胞超微结构中并未见到有显著的空泡增多、细胞溶解等细胞损害现象相一致。
硒化壳聚糖可促过参与深部损伤修复的主要细胞皮肤成纤维细胞增殖，也能明显促进参与浅表损伤修复的表皮细胞增殖，提示硒化壳聚糖具有良好的促创面愈合的药理作用，其作用机制及作用剂型值得进一步深入研究和开发。
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