基于气相色谱质谱的脂肪萎缩小鼠血浆代谢组学研究(1)
摘要目的：脂肪萎缩是引起糖脂代谢紊乱的重要因素之一。通过气相色谱质谱联用(GCMS)技术分析aP2nSREBP1c脂肪萎缩小鼠血浆代谢谱的变化，研究与其密切相关的差异代谢物与代谢通路，探讨其生物学基础。方法：应用GCMS技术对6只同窝野生型小鼠和6只转基因小鼠血浆样品进行检测，对检测结果进行多元统计分析，筛选出显著差异的代谢物，借助MetaboAnalyst分析代谢通路。结果：与野生型(wildtype，WT)小鼠比较，转基因(transgenic，TG)小鼠血浆中乳酸、L缬氨酸、3羟基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕榈酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。代谢通路富集分析发现3条脂肪萎缩相关通路。结论：通过对aP2nSREBP1c小鼠血浆代谢组学分析，发现缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，丙酮酸代谢，磷酸肌醇代谢途径与脂肪萎缩相关，为阐明糖脂代谢性疾病的发病机制提供了代谢组学依据。
关键词脂肪萎缩;气相色谱质谱联用;代谢组学
中图分类号：R917文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.009
脂肪萎缩是一种异质性、遗传性或获得性疾病，主要特征是身体脂肪的选择性丧失[1]。过量的脂肪累积或组织萎缩导致脂肪对脂质的储存能力不足，引起外周组织脂毒性损伤和低度炎性反应，增加糖尿病和动脉粥样硬化等糖脂代谢性疾病风险[2]。近年来国内外已有相关文献应用代谢组学技术对肥胖症进行研究，发现了许多与肥胖相关的代谢标志物[35]，但是在脂肪萎缩的代谢组学方面的研究是缺乏的。事实上，脂肪萎缩的遗传突变表型在代谢综合征中并不罕见;脂肪萎缩与肥胖可同时发生，其代谢后果相似可能叠加[67]。因此，研究脂肪萎缩下小分子代謝物的变化有利于更加全面认识糖脂代谢性疾病的发病机制，并在此基础上研发防治策略和药物。
近年来，代谢组学的快速发展为生命科学的研究提供许多便捷，它能定量检测生物体在病理生理刺激或遗传环境因素改变下所产生的动态变化，对于明晰机体发生的代谢变化指出方向。目前，多种分析技术应用于代谢组学研究，而GCMS的应用较为广泛，其特点包括较高检测灵敏度和可供参考的标准谱图库，能够定性分析代谢产物[8]。aP2nSREBP1c转基因小鼠具有白色脂肪少，棕色脂肪肥大的特点。随年龄增加，肝脏脂肪异位沉积逐渐加重，并且伴有严重的胰岛素抵抗问题[9]。由于糖脂代谢紊乱和脂肪生成分化障碍，该小鼠曾用作先天遗传引起的脂肪萎缩症或糖尿病研究[1011]。本实验主要借助GCMS仪器对aP2nSREBP1c转基因小鼠的血浆样品进行代谢组学检测与分析，旨在探究脂肪萎缩条件下血浆代谢物的变化，现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物aP2nSREBP1c转基因小鼠由美国Jackson实验室引进，委托南京大学模式动物研究所净化，动物合格证编号：J003393 SCXK(苏)20100001。动物实验期间均饲养于广东药科大学实验动物中心。饲养繁殖条件：SPF级动物房，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，12 h：12 h昼夜间断照明，进食普通饲料，自由饮食饮水。
1.1.2试剂与仪器涡旋混合器(德国IKA公司);台式高速冷冻离心机(美国SCILOGEX公司);DK8D电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司);HGC24A型氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展有限公司);Agilent 7890B/5977B型气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)。甲醇(色谱纯，德国Merck公司);甲氧胺盐酸盐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F1601013);吡啶(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);N，O双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)(87VMHMM，东京化成工业株式会社);正庚烷(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司);超纯水。
1.2方法
1.2.1动物分组aP2nSREBP1c转基因小鼠是C57BL/6J和SJL背景的杂合子个体，参照Jackson实验室基因型鉴定方法鉴定转基因型和野生型，根据基因型把小鼠分为WT组和TG组。
1.2.2检测指标与方法
1)脂肪组织形态观察：经乙醚麻醉侧眼底静脉丛取血后处死小鼠，迅速分离脂肪组织，置于4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片，HE染色，进行病理形态观察分析。
2)血浆样品获取与前处理：10周龄小鼠12 h禁食后经乙醚麻醉，侧眼底静脉丛取血，肝素钠抗凝，离心(3 000 r/min，4 ℃，15 min)取血浆。吸取50 μL新鲜血浆于离心管中，加入200 μL甲醇沉淀蛋白质，涡旋混匀1 min，离心10 min(15 000 r/min，4 ℃)，取上清液200 μL氮气吹干。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，混匀，在70 ℃下肟化1 h。加入50 μL BSTFA(含1%TMCS)，在70 ℃水浴下衍生化1 h。加入50 μL正庚烷，涡旋混匀后离心移取上清至微量进样管，待GCMS分析。
3)测定条件：色谱柱：HP5MS(60 m×250 μm×0.25 μm);进样量：1 μL;进样口温度：260 ℃;进样模式：不分流进样。升温程序：起始温度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至210 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至350 ℃保持3 min。电离方式：EI;电子轰击能量：70eV;离子源温度：230 ℃;四级杆温度：150 ℃;溶剂延迟：11 min。
4)数据处理及差异代谢物筛选：使用GCMS联用仪对血浆样品进行检测分析，经过积分后利用美国国家标准与技术局化学数据库(NIST)进行化合物比对。将比对后的数据导入MetaboAnalyst(https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)在线分析网站，采用无监督模式识别的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)观察各组分分离趋势，根据倍数变化>1.5和P<0.05筛选差异代谢物[12]，以匹配分数大于80的鉴定结果作为可信结果。, http://www.100md.com(吴琪 吴雅韵 韦世杰 余玉英)
关键词脂肪萎缩;气相色谱质谱联用;代谢组学
中图分类号：R917文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.009
脂肪萎缩是一种异质性、遗传性或获得性疾病，主要特征是身体脂肪的选择性丧失[1]。过量的脂肪累积或组织萎缩导致脂肪对脂质的储存能力不足，引起外周组织脂毒性损伤和低度炎性反应，增加糖尿病和动脉粥样硬化等糖脂代谢性疾病风险[2]。近年来国内外已有相关文献应用代谢组学技术对肥胖症进行研究，发现了许多与肥胖相关的代谢标志物[35]，但是在脂肪萎缩的代谢组学方面的研究是缺乏的。事实上，脂肪萎缩的遗传突变表型在代谢综合征中并不罕见;脂肪萎缩与肥胖可同时发生，其代谢后果相似可能叠加[67]。因此，研究脂肪萎缩下小分子代謝物的变化有利于更加全面认识糖脂代谢性疾病的发病机制，并在此基础上研发防治策略和药物。
近年来，代谢组学的快速发展为生命科学的研究提供许多便捷，它能定量检测生物体在病理生理刺激或遗传环境因素改变下所产生的动态变化，对于明晰机体发生的代谢变化指出方向。目前，多种分析技术应用于代谢组学研究，而GCMS的应用较为广泛，其特点包括较高检测灵敏度和可供参考的标准谱图库，能够定性分析代谢产物[8]。aP2nSREBP1c转基因小鼠具有白色脂肪少，棕色脂肪肥大的特点。随年龄增加，肝脏脂肪异位沉积逐渐加重，并且伴有严重的胰岛素抵抗问题[9]。由于糖脂代谢紊乱和脂肪生成分化障碍，该小鼠曾用作先天遗传引起的脂肪萎缩症或糖尿病研究[1011]。本实验主要借助GCMS仪器对aP2nSREBP1c转基因小鼠的血浆样品进行代谢组学检测与分析，旨在探究脂肪萎缩条件下血浆代谢物的变化，现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物aP2nSREBP1c转基因小鼠由美国Jackson实验室引进，委托南京大学模式动物研究所净化，动物合格证编号：J003393 SCXK(苏)20100001。动物实验期间均饲养于广东药科大学实验动物中心。饲养繁殖条件：SPF级动物房，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，12 h：12 h昼夜间断照明，进食普通饲料，自由饮食饮水。
1.1.2试剂与仪器涡旋混合器(德国IKA公司);台式高速冷冻离心机(美国SCILOGEX公司);DK8D电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司);HGC24A型氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展有限公司);Agilent 7890B/5977B型气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)。甲醇(色谱纯，德国Merck公司);甲氧胺盐酸盐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F1601013);吡啶(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);N，O双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)(87VMHMM，东京化成工业株式会社);正庚烷(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司);超纯水。
1.2方法
1.2.1动物分组aP2nSREBP1c转基因小鼠是C57BL/6J和SJL背景的杂合子个体，参照Jackson实验室基因型鉴定方法鉴定转基因型和野生型，根据基因型把小鼠分为WT组和TG组。
1.2.2检测指标与方法
1)脂肪组织形态观察：经乙醚麻醉侧眼底静脉丛取血后处死小鼠，迅速分离脂肪组织，置于4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片，HE染色，进行病理形态观察分析。
2)血浆样品获取与前处理：10周龄小鼠12 h禁食后经乙醚麻醉，侧眼底静脉丛取血，肝素钠抗凝，离心(3 000 r/min，4 ℃，15 min)取血浆。吸取50 μL新鲜血浆于离心管中，加入200 μL甲醇沉淀蛋白质，涡旋混匀1 min，离心10 min(15 000 r/min，4 ℃)，取上清液200 μL氮气吹干。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，混匀，在70 ℃下肟化1 h。加入50 μL BSTFA(含1%TMCS)，在70 ℃水浴下衍生化1 h。加入50 μL正庚烷，涡旋混匀后离心移取上清至微量进样管，待GCMS分析。
3)测定条件：色谱柱：HP5MS(60 m×250 μm×0.25 μm);进样量：1 μL;进样口温度：260 ℃;进样模式：不分流进样。升温程序：起始温度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至210 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至350 ℃保持3 min。电离方式：EI;电子轰击能量：70eV;离子源温度：230 ℃;四级杆温度：150 ℃;溶剂延迟：11 min。
4)数据处理及差异代谢物筛选：使用GCMS联用仪对血浆样品进行检测分析，经过积分后利用美国国家标准与技术局化学数据库(NIST)进行化合物比对。将比对后的数据导入MetaboAnalyst(https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)在线分析网站，采用无监督模式识别的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)观察各组分分离趋势，根据倍数变化>1.5和P<0.05筛选差异代谢物[12]，以匹配分数大于80的鉴定结果作为可信结果。, http://www.100md.com(吴琪 吴雅韵 韦世杰 余玉英)