p53基因第72位密码子基因多态性(1)
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[摘要] 目的 探讨湖北地区汉族女性人群中p53基因第72位密码子基因多态性与HPV16相关宫颈癌发生的关系。 方法 随机选取经PCR检测证实HPV16阳性的宫颈病变病例228例，其中病理证实为宫颈浸润癌的156例作为宫颈癌组，宫颈上皮内瘤变或宫颈炎72例为对照组。用直接PCR法检测新鲜组织标本中p53基因第72位密码子的基因型在宫颈癌组与对照组的分布情况，分析p53 codon72基因多态性与HPV16阳性宫颈癌之间的相关性。 结果 所有样本均成功检测出p53 codon72基因型。Pro/Pro、Arg/Pro、Arg/Arg在HPV阳性宫颈癌样本中所占比例分别为22.2%、47.2%、30.6%；在对照组中的比例分别为32.7%、53.2%、14.1%。两组总构成比差异有统计学意义(P = 0.010)。与其他两种基因型相比，p53 codon72Arg/Arg基因型在HPV16阳性宫颈癌样本检出率明显高于在HPV16阳性宫颈上皮内瘤变及宫颈炎组中的检出率(P = 0.004，OR = 2.680)。 结论 p53 codon72Arg/Arg基因型是湖北地区汉族女性发生HPV16相关宫颈癌的遗传易感因素。
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[关键词] 宫颈癌；p53基因；基因多态性；人乳头状瘤病毒16型(HPV16)
[中图分类号] R392[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721(2012)03(b)-0009-03
人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型感染是发生宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌的最主要病因。HPV16E6基因所表达的E6蛋白是重要原癌蛋白之一，高危型HPV16E6蛋白对p53蛋白的降解、灭活与宫颈癌发生有关的观点已被广泛接受。p53 codon72Arg/Arg基因型对于HPV16E6蛋白所介导的P53蛋白的降解更敏感，p53 codon72Arg/Arg基因型妇女较携带Arg/Pro基因型妇女患HPV相关宫颈癌的危险性更高，而p53 codon72Pro/Pro基因型与HPV相关宫颈癌发生的危险性无关[1]。国内外诸多学者就此进行了大量的研究，但结果不尽一致[2]。湖北省是宫颈癌的高发地区之一，研究发现，HPV16是该地区宫颈癌患者主要感染亚型(81.25%)[3]。p53基因第72位密码子多态性与HPV16感染宫颈癌相关性对与宫颈癌基因水平的筛查有重大意义。本研究运用直接PCR法检测p53基因3种基因型在HPV16阳性宫颈癌组及宫颈上皮内瘤变-宫颈炎组中的分布情况，探讨湖北地区汉族人群中p53基因多态性与HPV16相关宫颈癌的联系。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2007年5月～2009年7月因宫颈病变在武汉大学中南医院妇瘤科行宫颈活检或手术的病例228例，包括156例宫颈癌，72例宫颈上皮内瘤变或宫颈炎，所有样本均经病理诊断确诊(鳞癌149例、腺癌7例、CINⅡ～Ⅲ54例、宫颈炎-CINⅠ18例)，患者知情同意，术后新鲜组织标本保存于-70℃低温冰箱中；所有病例经PCR检测证实HPV16感染。患者均为长期居留于湖北地区的汉族女性。宫颈上皮内瘤变或宫颈炎者作为对照组，年龄25～48岁，平均41岁，宫颈癌组年龄28～64岁，平均43岁，各组样本年龄分布差异无统计学意义(P = 0.27)。
1.2 主要试剂
PCR引物由上海生工生物公司合成，具体见表1；DNATaq酶及DNA maker DL500均购自北京天根公司。
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1.3 DNA提取
用蛋白酶K-苯酚法提取样品组织DNA，产物溶于TE缓冲液中，置-20℃冰箱中备用。提取基因组产物均经β-globin球蛋白引物行PCR扩增，验证所提取DNA质量。
1.4 PCR扩增反应
总体系20 μL：DNA样本1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×Taq PCR Mix试剂10 μL，去离子双蒸水7 μL，于冰上混匀，矿物油封顶。PCR反应以p53 Arg/Pro杂合子样本为阳性对照，双蒸水为阴性对照。扩增程序为为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环；72℃最后延伸5 min。
1.5 电泳
使用0.5×TBE电泳缓冲液，PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶(含1%溴化乙锭)中电泳30 min(100 V，80 mA)。置于紫外灯下观察，β-globin扩增者在267 bp处出现亮带者为阳性，否则为阴性，β-globin阴性者则需再次行基因提取及扩增。p53基因多态性检测中，扩增产物仅在141 bp处有亮带则为Arg/Arg基因型，若扩增产物仅在177 bp处有亮带则为Pro/Pro基因型，同时在141 bp处及177 bp处见亮带则该样本基因型为Arg/Pro。
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1.6 统计学处理
用SPSS 13.0软件行χ2检验及Fish精确检验统计分析，计算相关危险度及其95%置信区间以进行危险度评价，P < 0.05为有差异有统计学意义。
2 结果
p53 codon72三种基因型Pro/Pro、Arg/Pro、Arg/Arg在HPV阳性宫颈癌样本中所占比例分别是22.2%、47.2%、30.6%；三者在宫颈上皮内瘤变-宫颈炎组HPV16阳性样本中的比例分别为32.7%、53.2%、14.1%，两组总构成比差异有统计学意义(P = 0.010)，见表2。
Arg/Arg基因型与Arg/Pro及Pro/Pro基因型二者总和比较，Arg/Arg基因型在HPV16阳性宫颈癌组中所占比例与对照组差异有统计学意义(P = 0.004)，其发生宫颈癌的相关危险度为2.680，95%置信区间为1.365～5.260。
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3 讨论
人乳头状瘤病毒感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的主要病因，宫颈癌患者的HPV检出率达93%，其中HPV16型感染率超过50%，是CIN和宫颈癌中最常见的高危HPV亚型[4]。笔者在湖北地区研究发现HPV16亚型感染是本地区宫颈癌的主要高危因素[3，5]，高于欧、美一些国家的研究结果(56.2%～64.1%)[6]。反映了湖北地区高危型HPV的流行具有其地域特点。
HPV16E6基因产物E6蛋白与细胞癌基因和抑癌基因的相互作用是致癌的中心环节之一，HPV16E6蛋白能通过与细胞内抑癌蛋白p53作用抑制p53的功能，E6持续表达，从而引起细胞恶性转化。p53基因第72位密码子多态性在体内能改变E6、E6AP或泛素依赖途径中其他成分与p53的联结。Storey A等[1]报道，高危型HPV E6对Arg型p53的降解能力更强。国内、外研究结果不尽一致，归因于p53 codon72基因型多态性存在对宫颈癌的影响存在种族和地域的差异[2]。Jee SH等[7]分析世界范围内的70项研究得出结论：p53 codon72Arg/Arg基因型与Arg/Pro基因型比例在HPV16阳性宫颈癌中的分布有差异(P = 0.002，OR = 1.5，95%CI = 1.2～1.9)。
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本研究发现在湖北地区汉族人群中p53 codon72基因型比例在HPV16阳性宫颈病变不同进展阶段中的分布有明显差异，提示p53基因第72位密码子多态性与HPV16相关的宫颈病变发生发展密切相关。国内四川[8]和贵州[9]的研究报道也支持p53 codon72Arg/Arg基因型是HPV相关宫颈癌的高危因素之一，而广东[10]和新疆[11]对汉族人群p53基因第72位密码子基因多态性的研究则得出相反结论。对于汉族人群，国内各地区研究结果不尽一致，其主要原因应考虑各地域汉族人群基因差异和其他因素影响宫颈癌的发生。一方面，人群中Arg/Arg基因型比例对研究结果有明显影响，支持Arg/Arg基因型是宫颈癌发病的遗传易感因素的研究，如希腊[12]、南非[13]等人群中Arg/Arg基因型比例均较低(9%～20%)；而在人群中Arg/Arg基因型比例高的美国白人(47%～56%)的研究[14]则显示二者无相关性，国内研究也可发现类似特点。另一方面，还有高危型HPV16病毒E6基因变异影响，Duin MV等[15]认为在p53 Arg/Arg妇女中，感染HPV16E6 350T变异株发生宫颈癌风险更高；湖北地区主要流行的HPV16变异株为E6 D25E变异[16]，对p53基因多态性与宫颈癌的相关性的影响还有待进一步研究。, 百拇医药(陈长春 丁晓华 蔡红兵)